in
en

Apakah PCR Waktu-Riil itu ?

Lauren head shot

Oleh Lauren Bambusch

Ketika berbicara dengan manajer keamanan makanan yang mencoba untuk meng-upgrade metode pengujian mereka, kita sering ditanya - Apakah PCR waktu-riil itu ? Bagaimana cara kerjanya? Jawaban cepat adalah: PCR (polymerase chain reaction atau, bagi mereka kutu buku ilmu pengetahuan di luar sana) adalah teknik untuk melipatgandakan jutaan kali seuntai tertentu DNA atau RNA dengan cara memanipulasi mesin alami sel. Setelah dilipatgandakan atau diamplifikasi, DNA target dapat dengan mudah dideteksi dengan berbagai metode.

Tapi bagaimana cara kerjanya? PCR, seperti yang dikembangkan dalam bentuk modern oleh Dr Kary Mullis pada tahun 1980, adalah sebuah proses yang cukup sederhana pada inti nya - mengambil satu untai atau segmen DNA, tambahkan sedikit blok bangunan kehidupan, sebuah smidge primer (segmen DNA kecil yang memberitahu mesin seluler 'mulailah menyalin dari sini'), aduk di sejumlah mesin seluler (yang mana kata polimerase datang), dan siklus antara suhu tinggi dan rendah 30-50 kali, proses yang disebut thermocycling. Zaman sekarang kita memiliki instrumen seperti Hunter nya InstantLabs yang secara otomatis mendaur (cycle) antara suhu, memungkinkan Anda untuk duduk kembali dan bersantai sambil sihirnya bekerja, tetapi pada hari-hari awal PCR, thermocycling dilakukan secara manual oleh mahasiswa pascasarjana, yang memindahkan tabung PCR kecil antara bak (bath) air panas dan hangat setiap 30-60 detik selama beberapa jam (Syukurlah saya terlalu muda untuk pernah harus melakukannya sendiri).
Apakah Anda secara manual menyeret bolak balik tabung atau dapat bersantai sementara alat otomatis melakukan itu untuk Anda, inilah cara kerjanya:

1. Campurkan bahan-bahan
Pertama, Anda akan memerlukan sampel dengan segmen DNA potensial yang Anda ingin memverifikasi. Segala macam DNA bekerja untuk ini - bakteri, hewan, tumbuhan, manusia - pada tingkat yang paling dasar, mereka semua sama. Kedua Anda akan memerlukan blok bangunan kehidupan; sebuah penyangga (buffer) kation, dan yang paling penting, hal-hal yang disebut nukleotida, yang membuat 'kode' genetik. Juga, Anda akan perlu polymerase - ini merupakan juru tulis Anda, mesin yang bergerak secara perlahan di sepanjang untaian DNA, bereplikasi berurutan saat berjalannya. Terakhir, Anda akan memerlukan beberapa primer. Ini adalah segmen-segmen pendek DNA yang dapat mengikat sebuah segmen DNA beruntai tunggal dan memberikan polimerase sesuatu untuk berpegang ketika mulai menyalinnya.

2. Panaskan campuran tersebut
DNA yang dikemas secara aman dalam sebuah formasi heliks ganda - dua untaian yang membungkus satu sama lain dalam bentuk seperti sebuah koil. Hal ini membantu untuk melindungi dan menampung bagian DNA yang diberi kode, tetapi pada saat yang sama berfungsi untuk menyembunyikannya . Untuk memecahkan heliks yang terbuka, Anda menambahkan panas dan untaian DNA ganda diluruskan dan Anda memiliki dua untai tunggal untuk bermain dengan.

3. Dinginkan kembali campuran tersebut
DNA bukan satu-satunya barang yang rentan terhadap panas. Pada suhu tinggi mesin seluler tidak sepenuhnya operasional, tapi mendinginkannya kembali dan primer mulai melekat pada segmen DNA yang cocok agar polymerase dapat bergerak dengan perlahan bersama pembuatan salinan di sepanjang jalan.

4. Tunggu sedikit
Tidak butuh waktu lama, dari 10-30 detik dan polymerase telah membuat sebuah salinan untuk Anda yang sempurna dari segmen DNA.

PCR_Math

5. Ulangi sesuai kebutuhan
Butuh lebih dari satu salinan? Hanya ulangi proses sampai Anda memiliki sebanyak DNA yang Anda butuhkan.
Setiap siklus menggandakan jumlah target DNA yang ada dalam sampel. Sebagaimana siklus berulang, demikian juga dua kali lipat dari jumlah segmen DNA. Akibat kekuatan pertumbuhan eksponensial, Anda dengan cepat mendapatkan jumlah yang sangat besar salinan DNA; Anda akan memiliki 2.048 eksemplar setelah hanya sepuluh siklus pertama. Setelah 30 siklus? Anda akan memiliki lebih dari 1 Milyar salinan. Ya, itulah Milyar, dengan "M".

Anda mungkin bertanya-tanya apa yang Anda lakukan dengan semua salinan DNA itu. Anda dapat melakukan banyak hal, tetapi ketika Anda sedang berburu untuk target DNA tertentu, katakanlah sebuah bakteri Salmonella, Anda juga menambahkan tanda-tanda pengenal (tag) neon kecil ke dalam campuran, yang disebut probe. Bila Anda menambahkan energi dalam bentuk panjang gelombang tertentu dari cahaya, bagian neon probe yang tergairah (excited), melepaskan sebuah ledakan kecil cahaya dalam panjang gelombang yang berbeda, semacam seperti kode Morse berwarna. Satu ledakan kecil cahaya, atau bahkan 2, 4 atau 8, ini terlalu kecil untuk bahkan instrumen yang paling sensitif untuk mendeteksinya.

E. coli graph 2

Tapi jika Anda memiliki satu juta eksemplar? Satu Milyar? Itu adalah cerita lain. Karena instrumen Anda mendeteksi cahaya, hal ini menerjemahkannya menjadi 'DNA DITEMUKAN DI SINI!' Sinyal yang disebut unit cahaya relatif (relative light units - RLUs). Semakin banyak DNA, semakin terang sinyalnya. Itulah yang membuat kurva klasik PCR naik secara eksponensial.
Dan itu, Bapak2 dan Ibu2, merupakan waktu PCR riil. Jika Anda tertarik, duplikasi tidak berlangsung selamanya. Setiap replikasi akan menghabiskan sedikit blok bangunan yang telah ditambahkan ke reaksi; setelah mereka habis, cobalah yang Anda mau, replikasi berakhir dan kurva PCR mendatar. Betapapun juga, Anda tidak dapat memanggang roti jika Anda tidak memiliki lagi tepung apapun.

Seperti yang dapat Anda bayangkan, karena PCR mencari sebuah pencocokan tepat antara DNA target dan primer, itu bisa menjadi sangat tepat. Kemampuannya mengubah satu salinan DNA menjadi milyaran memungkinkan PCR menjadi sangat sensitif. Ini adalah alat yang hebat untuk mendeteksi patogen dalam makanan-atau salah satu DNA-hampir di mana saja.

Sebuah diskusi tentang asal-usul dan aplikasi PCR dalam berbagai bentuk belum lengkap tanpa sebuah anggukan kepada Dr. Kary Mullis, cemerlang dan ... ehem ... seorang yang menarik. Pada kenyataannya, dia atribut penemuan PCR ke penggunaan LSD jangka panjangnya, mengatakan bahwa dalam sebuah wawancara tahun 1997, "Bagaimana jika saya tidak pernah mengambil LSD ; akan saya masih menciptakan PCR? Aku tidak tahu. Aku meragukannya. Saya benar-benar ragu itu. "Nah, ini untuk Kary Mullis dan rute ilmu pengetahuannya yang tidak konvensional . Untuk mengetahui lebih lanjut, ambillah bukunya Mullis Dancing Naked in the Mind Field, yang akan membuat Anda tertawa keras melihat ke dalam pikiran yang menarik dan blak-blakan dari pemenang Nobel ini

-- Tampilan terbaik menggunakan Versi terbaru dari Mozilla Firefox, Google Chrome, Internet Explorer, Opera --
Dengan resolusi monitor, minimal 1024 x 768